引言

本系列[1]将开展全新的转录组分析专栏，主要针对使用DESeq2时可能出现的问题和方法进行展开。

往期复习

结果列的详细信息

您可以通过执行 mcols 函数来获取结果对象中涉及的变量和测试的详细信息。

mcols(res)$description

对于一个特定的基因，如果处理组与未处理组的对数变化倍数（log2 fold change）为-1，这意味着处理使得基因表达水平相对于未处理组下降了一半（即乘法变化为0.5）。如果关注的变量是连续变量，那么报告的对数变化倍数表示该变量每变化一个单位时的倍数变化。

关于 p 值设为 NA 的说明：结果表中的某些值可能因为以下原因被设为 NA：

• 如果一行中的所有样本计数都为零，那么 baseMean 列将显示为零，对应的对数变化倍数估计值、p 值和调整后的 p 值都会设为 NA。
• 如果一行中的样本存在极端计数异常值，那么 p 值和调整后的 p 值会被设为 NA。这些异常值是通过 Cook's distance 检测出来的。下文将介绍如何自定义异常值过滤以及如何替换异常值和重新拟合。
• 如果一行因为自动独立过滤而被筛选掉，因为其平均标准化计数较低，那么只有调整后的 p 值会被设为 NA。下文将介绍独立过滤的描述和自定义方法。

结果的丰富可视化和报告

• regionReport：使用 regionReport 包可以生成包含图表的结果 HTML 和 PDF 摘要。DESeq2Report 函数应在经过 DESeq 函数处理的 DESeqDataSet 上运行。
• Glimma：使用 Glimma 包可以生成包括 MA-plots（也称为 MD-plots）在内的 DESeq2 输出的交互式可视化。
• pcaExplorer：使用 pcaExplorer 包可以生成包括 PCA 图、计数箱线图和其他有用摘要的 DESeq2 输出的交互式可视化。
• iSEE：iSEE 提供了创建基于 Shiny 的交互式图形用户界面的函数，用于探索存储在 SummarizedExperiment 对象中的数据，包括行和列级别的元数据。特别关注 SingleCellExperiment 对象中的单细胞数据，并可视化降维结果。
• iSEEde 包提供了额外的面板，以促进 iSEE 应用程序中差异表达结果的交互式可视化。
• DEvis：DEvis 是一个强大的、集成的解决方案，用于分析差异表达数据。该包包括一系列用于操作和聚合数据的工具，以及一系列可定制的可视化和项目管理功能，简化了 RNA-Seq 分析，并提供了多种探索和分析数据的方法。

导出 CSV 文件

可以使用 R 基础函数 write.csv 或 write.delim 将结果导出为纯文本文件。建议使用描述性的文件名，以指示被测试的变量和水平。

write.csv(as.data.frame(resOrdered), file="condition_treated_results.csv")

仅导出通过调整后的 p 值阈值的结果可以使用 subset 函数，然后使用 write.csv 函数来完成。

resSig <- subset(resOrdered, padj < 0.1)
resSig

多因素实验设计

当实验受到多个因素的影响时，可以使用包含额外变量的设计公式来分析这些实验。实际上，DESeq2能够处理任何可以用固定效应项来描述的实验设计，包括多因素设计、包含交互作用的设计、涉及连续变量的设计、样条函数等。

通过在设计公式中加入额外的变量，可以控制计数数据中的额外变异。例如，如果实验条件样本在不同实验批次中分布均匀，将批次作为一个因素纳入设计中，可以提高发现由条件引起的差异的敏感性。当这些额外变量本身也是研究的重点，而不仅仅是控制变量时，有多种分析方法可供选择。

大规模样本实验：在样本数量众多的实验中（例如50个或100个样本），技术变异很可能会影响观察到的计数数据。如果忽视这种技术变异，可能会导致错误的结果。有许多方法可以用来模拟这种技术变异，并且这些方法可以轻松地整合到DESeq2的设计中，以便在估计感兴趣的效应的同时控制技术变异。

pasilla包中的数据包含了感兴趣的条件（“条件”列），以及关于进行的测序类型的信息（“类型”列），如下所示：

colData(dds)

创建 DESeqDataSet 的副本，以便可以使用多因素设计重新运行分析

ddsMF <- dds

将 type 的水平调整为仅包含字母（设计因子水平中也可以包括数字、下划线和句点）。更改水平名称时，请务必保持与当前顺序一致，以避免出错。

levels(ddsMF$type)
## [1] "paired-end"  "single-read"

levels(ddsMF$type) <- sub("-.*", "", levels(ddsMF$type))
levels(ddsMF$type)
## [1] "paired" "single"

能够考虑不同测序技术的差别，并更清楚地揭示由处理引起的差异。条件作为关注的主要变量，被放在了公式的最后部分。因此，默认情况下，结果函数会提取与条件相关的结果，除非用户特别指定了对比或命名参数。

接下来，可以再次执行 DESeq 分析：

design(ddsMF) <- formula(~ type + condition)
ddsMF <- DESeq(ddsMF)

再次，使用 results 函数访问结果。

resMF <- results(ddsMF)
head(resMF)

还可以获取设计中最后一个变量以外的其他变量的 log2 倍数变化、p 值以及调整后的 p 值。以 type 为例，尽管它仅仅表示测序协议之间的差异，缺乏生物学意义，但在某些假设设计中，例如 ~genotype + condition + genotype:condition，可能对不同 genotype 之间的基线表达差异感兴趣，而 genotype 并非设计中的最后一个变量。

通常情况下，函数 results 的 contrast 参数要求一个包含三个元素的字符向量：变量名称、作为 log2 比率分子的因子水平名称，以及作为分母的因子水平名称。

resMFType <- results(ddsMF,
                     contrast=c("type", "single", "paired"))
head(resMFType)

对于连续变量或交互项（详见交互项部分），可以通过设置 results 函数的 name 参数来提取结果，其中 name 应对应于 resultsNames(dds) 返回的某个元素。